TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過(guò)評(píng)估TCR與人體自身抗原肽的交叉識(shí)別能力來(lái)評(píng)估。首先，應(yīng)采用體外試驗(yàn)測(cè)定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說(shuō)明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識(shí)別基序（motif），并采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析評(píng)估交叉反應(yīng)性。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)可識(shí)別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測(cè)定TCR修飾免疫細(xì)胞對(duì)表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識(shí)別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來(lái)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。對(duì)于TCR修飾的T細(xì)胞，還應(yīng)關(guān)注引入TCR鏈和內(nèi)源性TCR之間的錯(cuò)配可能性，應(yīng)描述和說(shuō)明旨在降低錯(cuò)配可能性的TCR設(shè)計(jì)策略。隨著脫靶影響因素、降低策略及脫靶檢測(cè)技術(shù)研究的不斷深入，未來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在更多領(lǐng)域造福人類。嘉興定量脫靶檢測(cè)

CIRCLE-seq原理。細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)方法由于提純的基因組已經(jīng)消化去除了組蛋白，結(jié)構(gòu)較細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)更為松散，理論上容易找到更多的脫靶位點(diǎn)。為捕獲CRISPR在細(xì)胞內(nèi)工作時(shí)真實(shí)發(fā)生的脫靶切割，研究者們也設(shè)計(jì)了一些細(xì)胞內(nèi)的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA雙鏈斷裂后，由于DNA修復(fù)機(jī)制的存在，斷裂處很快就會(huì)重新連接，這時(shí)候提純基因組DNA很難保留CRISPR造成的DNA斷裂位點(diǎn)。所以為了記錄細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的CRISPR脫靶切割，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修復(fù)機(jī)制，將一段雙鏈短核苷酸序列（dsODN）連接到CRISPR造成的DNA雙鏈斷裂處，相當(dāng)于連接了一輪接頭，然后再正常打斷基因組，在另一側(cè)連接第二輪接頭。通過(guò)這種方式構(gòu)建的文庫(kù)，就可以獲取脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。雖然每次CRIPSR導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂并不一定都會(huì)連接dsODN，但反過(guò)來(lái)說(shuō)，越容易連接dsODN的位點(diǎn)，其發(fā)生脫靶切割的概率越高。通過(guò)Guide-seq找到的脫靶位點(diǎn)偏少，但一般都是可信度較高的脫靶位點(diǎn)，Guide-seq也是目前比較公認(rèn)的一種脫靶檢測(cè)方法。北京脫靶檢測(cè)技術(shù)基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

對(duì)于基因修飾細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產(chǎn)品的作用機(jī)制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學(xué)合理性；（2）為臨床試驗(yàn)的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據(jù)；（3）根據(jù)潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，闡明毒性反應(yīng)特征，預(yù)測(cè)人體可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，確定不良反應(yīng)的臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)，為制定臨床風(fēng)險(xiǎn)控制措施提供參考依據(jù)。因此，應(yīng)充分開展非臨床研究，收集用于風(fēng)險(xiǎn)獲益評(píng)估的信息，以確立擬開發(fā)產(chǎn)品在目標(biāo)患者人群中預(yù)期具有合理的、可接受的獲益風(fēng)險(xiǎn)比，同時(shí)為臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和風(fēng)險(xiǎn)控制策略的制定提供支持性依據(jù)。

改進(jìn)Cas變體使用SpCas9和SaCas9 變體：已研發(fā)出諸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多種Cas變體，可降低脫靶效應(yīng)。改進(jìn)的Cas9同源物具有更廣的PAM功能和特異性：實(shí)驗(yàn)表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脫靶效應(yīng)。CRISPR 遞送方法：基于病毒的遞送方法：腺病毒 (AdV) 顯示出整合到靶細(xì)胞基因組中的微弱潛力，這一特征有利于限制脫靶效應(yīng)。然而，AdVs 會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，目前還不能完全排除它與宿主基因組整合的可能性。非病毒遞送方法：當(dāng)sgRNA和Cas9以RNP復(fù)合物形式傳遞時(shí)，電穿孔顯示植物原生質(zhì)體中的脫靶突變數(shù)量很低。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染傳遞RNP復(fù)合物顯示，與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染相比，脫靶突變的發(fā)生率較小。內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng),建立了一種被命名為GOTI。

CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞對(duì)于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細(xì)胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)盡可能采用多種方法評(píng)估其靶點(diǎn)相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于靶點(diǎn)相關(guān)毒性，應(yīng)采用體外方法深入分析靶點(diǎn)在人體qiguan、組織和細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，基因表達(dá)分析庫(kù)和文獻(xiàn)調(diào)研也可能會(huì)有助于闡明靶點(diǎn)在不同病理生理狀態(tài)下的表達(dá)是否存在差異。應(yīng)采用表達(dá)和不表達(dá)靶抗原的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，確認(rèn)CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞可特異性的識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞。對(duì)于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評(píng)估其胞外抗原識(shí)別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。可以與靶基因之外的其他基因作用而非特異性阻斷基因表達(dá),即產(chǎn)生非靶基因的沉默效應(yīng)。南通crispr脫靶檢測(cè)CRO

脫靶檢測(cè)簡(jiǎn)單有效的方法之一是全基因組測(cè)序法。嘉興定量脫靶檢測(cè)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)品。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell，iPS）自身具有致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，在體內(nèi)可形成畸胎瘤，整合病毒載體的使用和誘導(dǎo)多能性可能增加iPS細(xì)胞插入致突變性和致性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)在shou次臨床試驗(yàn)前完成致瘤性試驗(yàn)。若設(shè)計(jì)科學(xué)合理，能夠滿足評(píng)價(jià)要求，也可在持續(xù)時(shí)間足夠長(zhǎng)的毒性研究中評(píng)估致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)致瘤性試驗(yàn)建議采用摻入未分化iPS細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的靈敏度。如果iPS細(xì)胞設(shè)計(jì)了機(jī)制以降低致瘤風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)在體內(nèi)試驗(yàn)中確認(rèn)/驗(yàn)證此類機(jī)制的功能 嘉興定量脫靶檢測(cè)