本研究旨在解決傳統(tǒng)水凝膠生物墨水 3D 生物打印后難以快速穩(wěn)定、分辨率和保真度低的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了具有剪切變稀和自修復(fù)特性的氧化和甲基丙烯酸酯化海藻酸鹽（OMA）生物墨水。該墨水通過(guò)鈣離子交聯(lián)實(shí)現(xiàn)快速自修復(fù)穩(wěn)定，再經(jīng)光交聯(lián)增強(qiáng)力學(xué)性能，成功打印出高分辨率（ filament 直徑 223-361μm）、高保真度（92-110%）的復(fù)雜結(jié)構(gòu)（如懸垂結(jié)構(gòu)、耳朵模型等）。負(fù)載的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）存活率高，且在長(zhǎng)期培養(yǎng)中可分化為軟骨組織，為復(fù)雜功能組織工程提供了有效平臺(tái)。

思維導(dǎo)圖

1. 研究背景與挑戰(zhàn)· 

水凝膠的應(yīng)用基礎(chǔ)：水凝膠是親水性聚合物的 3D 網(wǎng)絡(luò)，因生物相容性好、可模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），***用于組織工程，但傳統(tǒng)水凝膠難以打印出復(fù)雜、高精度的 3D 結(jié)構(gòu)。

· 3D 生物打印的**問(wèn)題：多數(shù)水凝膠生物墨水?dāng)D出后無(wú)法快速穩(wěn)定，導(dǎo)致分辨率低、保真度差，難以形成自支撐結(jié)構(gòu)，限制了其在復(fù)雜組織構(gòu)建中的應(yīng)用。

· 研究目標(biāo)：開(kāi)發(fā)新型水凝膠生物墨水，需滿足高打印分辨率和保真度、可調(diào)力學(xué)性能和降解速率、高細(xì)胞活力。

2. OMA 生物墨水的制備·

 OMA 的合成：通過(guò)海藻酸鹽的氧化（使用高碘酸鈉）和甲基丙烯酸酯化（使用 2 - 氨基乙基甲基丙烯酸酯）制備，可調(diào)節(jié)氧化度（1%、2%）和甲基丙烯酸酯化度（5%、10%、20%）。

· 生物墨水配制：2 w/v% OMA 溶于 DMEM，添加 0.05 w/v% 光引發(fā)劑；與不同濃度硫酸鈣 slurry（0-210.0 mg/ml）混合，通過(guò)鈣離子交聯(lián)形成初始結(jié)構(gòu)，后續(xù)可經(jīng)紫外光（20 mW/cm2，1 min）二次交聯(lián)增強(qiáng)穩(wěn)定性。

3. 3D 生物打印系統(tǒng)與流程

· 打印機(jī)改裝：改裝 Printrbot 打印機(jī)，替換為注射器泵擠出系統(tǒng)，兼容 Cura 軟件；同時(shí)使用商用打印機(jī)（Biobot Basic、Bio X?）。

· 打印參數(shù)：使用 22G、25G、27G 針頭，通過(guò)對(duì)應(yīng)軟件控制，打印結(jié)構(gòu)包括立方體、字母、耳朵、懸垂結(jié)構(gòu)（碗、橋等）。

4. OMA 生物墨水的關(guān)鍵性能（流變學(xué)特性）

圖一、由高粘度海藻酸鹽合成的OMA（1OX20MA）生物油墨的表征。OMA生物墨水的粘度測(cè)量與（a）剪切力的關(guān)系速率和（B）剪應(yīng)力分別表明了其剪切減薄和剪切屈服行為。（C）OMA-15[OMA+15μl CaSO4（1.22M） ]、（D）OMA-20[OMA+20μl CaSO4（1.22 M）]、（E）OMA-25[OMA+25μl CaSO_4（1.22 M]）和（F）OMA-40[OMA+40μl CaS04（1.22M）]生物墨水表明OMA生物墨水具有機(jī)械穩(wěn)定性。（G）OMA-15、（H）OMA-20、（I）OMA-25和（J）OMA-40生物墨水的應(yīng)變掃描測(cè)試。OMA的G′和G′′交叉生物墨水作為剪切應(yīng)變的函數(shù)，在較高的剪切應(yīng)變下表現(xiàn)出凝膠到溶膠的轉(zhuǎn)變。（K）OMA-15、（L）動(dòng)態(tài)應(yīng)變?cè)囼?yàn)期間剪切模量的變化OMA-20、（M）OMA-25和（N）OMA-40生物墨水在1 Hz下具有交替的低（1%）和高（100%）應(yīng)變，表明它們?cè)诠腆w樣之間快速過(guò)渡并且在幾秒鐘內(nèi)表現(xiàn)出類(lèi)似液體的行為，這表明具有自愈或觸變特性。（O）使用BioX打印機(jī)上的OMA生物墨水的3D打印結(jié)構(gòu)（5×5×3 mm）的照片。

5. 3D 打印效果：分辨率與保真度

· 高分辨率：隨針頭內(nèi)徑減?。?2G：413μm→27G：210μm），打印 filament 直徑相應(yīng)減小（361μm→223μm），為針頭內(nèi)徑的 88-106%。

· 高保真度：10×10×5 mm 立方體打印后，尺寸保真度達(dá) 92-110%；復(fù)雜結(jié)構(gòu)（UIC 標(biāo)志、耳朵）及懸垂結(jié)構(gòu)（無(wú)需支撐）均能精細(xì)打印

6. 細(xì)胞活性與功能分化

· 細(xì)胞活力：hMSCs 負(fù)載濃度為 5×10? cells/ml，打印及光交聯(lián)后，Live/Dead 染色顯示高存活率。

· 軟骨分化：在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 周后，甲苯胺藍(lán)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性（紫色），GAG/DNA 含量***高于對(duì)照組（p<0.05），觀察到軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，表明形成功能性軟骨組織。

圖二 使用改良的Printrbot打印機(jī)與由高粘度藻酸鹽合成的負(fù)載hMSC的OMA生物墨水區(qū)分3D生物打印構(gòu)建體。代表性的（A）活的、（B）死的和（C）在第0天的光交聯(lián)3D打印結(jié)構(gòu)的合并顯微照片。在光交聯(lián)之前和之后使用負(fù)載hMSC的OMA生物墨水（D）3D打印耳朵。甲苯胺藍(lán)O染色前后軟骨分化的3D打印耳朵（F）和（G）。在（H）軟骨生成（Chondro）和（I）生長(zhǎng)培養(yǎng)基（對(duì)照）中培養(yǎng)的甲苯胺藍(lán)O染色構(gòu)建體切片的顯微照片。（J）3D打印構(gòu)建體中GAG/DNA的定量。白色、紅色和黑色刻度條分別表示200μm、1 cm和100μm。*與對(duì)照組相比，p<0.05。

7. 結(jié)論·

 OMA 生物墨水憑借剪切變稀、自修復(fù)及雙重交聯(lián)特性，解決了傳統(tǒng)水凝膠打印的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，實(shí)現(xiàn)高分辨率、高保真復(fù)雜結(jié)構(gòu)（包括懸垂結(jié)構(gòu)）的打印。

· 負(fù)載的 hMSCs 可存活并分化為功能組織，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供了高效、可擴(kuò)展的平臺(tái)。

關(guān)鍵問(wèn)題：

問(wèn)題：OMA 生物墨水相比傳統(tǒng)水凝膠生物墨水，在 3D 打印中解決了哪些**缺陷？

答案：傳統(tǒng)水凝膠生物墨水存在打印后難以快速穩(wěn)定、分辨率和保真度低、無(wú)法支撐復(fù)雜結(jié)構(gòu)（如懸垂結(jié)構(gòu)）的缺陷。OMA 生物墨水通過(guò)剪切變稀特性實(shí)現(xiàn)順利擠出，快速自修復(fù)特性（秒級(jí)恢復(fù)機(jī)械性能）確保打印后立即穩(wěn)定，雙重交聯(lián)（鈣交聯(lián) + 光交聯(lián)）增強(qiáng)力學(xué)性能，從而實(shí)現(xiàn)高分辨率（filament 直徑 223-361μm）、高保真度（92-110%），并能打印無(wú)需支撐的懸垂結(jié)構(gòu)，克服了傳統(tǒng)缺陷。

問(wèn)題：研究中如何驗(yàn)證 OMA 生物墨水打印結(jié)構(gòu)的功能可行性？

答案：通過(guò)干細(xì)胞負(fù)載與分化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能可行性：① 負(fù)載的 hMSCs 在打印及光交聯(lián)后存活率高；② 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 周，打印結(jié)構(gòu)保持高保真度，甲苯胺藍(lán)染色顯示 GAG 富集（強(qiáng)陽(yáng)性），觀察到軟骨陷窩結(jié)構(gòu)；③ GAG/DNA 含量***高于對(duì)照組（p<0.05），證明 hMSCs 成功分化為功能性軟骨組織，驗(yàn)證了打印結(jié)構(gòu)的功能可行性。

問(wèn)題：OMA 生物墨水的雙重交聯(lián)機(jī)制（鈣交聯(lián) + 光交聯(lián)）分別發(fā)揮了什么作用？

答案：① 鈣交聯(lián)：通過(guò)鈣離子與 OMA 的 ionic 作用實(shí)現(xiàn)初始交聯(lián)，賦予墨水剪切變稀和自修復(fù)特性，確保打印過(guò)程中順利擠出且打印后快速穩(wěn)定，維持結(jié)構(gòu)初步形態(tài)；② 光交聯(lián)：通過(guò)紫外光（20 mW/cm2，1 min）引發(fā)甲基丙烯酸酯基團(tuán)聚合，形成共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期力學(xué)穩(wěn)定性和降解抗性，支持干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)和功能分化。兩者結(jié)合實(shí)現(xiàn)了打印便捷性與結(jié)構(gòu)長(zhǎng)效性的平衡。

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