無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的模板可以是線性DNA（如PCR產(chǎn)物）或環(huán)狀質(zhì)粒，需包含啟動(dòng)子（如T7/T3/SP6）和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄翻譯。為提升效率，系統(tǒng)可能添加分子伴侶（如DnaK/GroEL）輔助蛋白折疊，或氧化還原劑（如谷胱甘肽）促進(jìn)二硫鍵形成。部分高級(jí)系統(tǒng)（如PURE體系）使用純化重組元件替代粗提物，實(shí)現(xiàn)更高可控性，但成本較高。無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可靈活引入非天然氨基酸（nnAA），擴(kuò)展了蛋白質(zhì)的功能多樣性。例如，通過(guò)定制tRNA和氨酰-tRNA合成酶，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)系統(tǒng)能準(zhǔn)確將熒光標(biāo)記或交聯(lián)基團(tuán)嵌入目標(biāo)蛋白，用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或藥物偶聯(lián)開發(fā)。更前沿的應(yīng)用是人工生命體系的構(gòu)建，如利用無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)合成噬菌體或人工細(xì)胞雛形，結(jié)合微流控技術(shù)模擬細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)，為合成生物學(xué)研究提供可控的簡(jiǎn)化模型。小麥胚芽裂解物??則憑借??低核酸酶活性??成為長(zhǎng)期反應(yīng)（>24小時(shí)）的理想選擇。his蛋白表達(dá)上調(diào)

中國(guó)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的政策布局更側(cè)重細(xì)胞工廠（如微生物發(fā)酵），對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)這類技術(shù)的專項(xiàng)扶持較少。盡管《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》提及無(wú)細(xì)胞合成，但配套資金和產(chǎn)業(yè)政策尚未細(xì)化，難以吸引資本大規(guī)模投入。此外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)涉及多學(xué)科交叉（合成生物學(xué)、微流控、AI建模），國(guó)內(nèi)既懂技術(shù)又懂產(chǎn)業(yè)化的復(fù)合型人才稀缺。反觀美國(guó)，DARPA等機(jī)構(gòu)通過(guò)“BioMADE”計(jì)劃資助無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的jun shi和民用轉(zhuǎn)化，而中國(guó)在類似頂層設(shè)計(jì)上的滯后，進(jìn)一步拉大了與國(guó)際前沿水平的差距。常用蛋白表達(dá)優(yōu)化CHO細(xì)胞重組蛋白表達(dá)??是生產(chǎn)抗體的常用技術(shù)。

相較于原核表達(dá)體系，真核體外蛋白表達(dá)的he xin優(yōu)勢(shì)在于具備部分翻譯后修飾能力，但 關(guān)鍵修飾途徑仍存在明顯局限。在缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的情況下，糖基化修飾通常終止于高甘露糖型（Man?GlcNAc?）階段，無(wú)法合成復(fù)雜雙觸角唾液酸化糖鏈。這一缺陷直接影響zhi liao性抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）效應(yīng)。同時(shí)，裂解物中二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）與分子伴侶（如BiP）的活性不足，導(dǎo)致含多對(duì)二硫鍵的蛋白錯(cuò)誤折疊率升高40%-60%。為克服此瓶頸，需在裂解物中外源性添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（如GnT-I/GnT-II/FUT8）以重構(gòu)修飾途徑，并通過(guò)優(yōu)化氧化還原電勢(shì)（Eh=-230 mV至-280 mV）改善二硫鍵形成效率。體外蛋白表達(dá)的這些修飾缺陷是目前制約其應(yīng)用于功能性糖蛋白生產(chǎn)的主要因素。

傳統(tǒng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)酶面臨周期長(zhǎng)（>72 小時(shí)）且純化復(fù)雜的瓶頸。新一代連續(xù)流體外蛋白表達(dá)系統(tǒng) 通過(guò)耦合反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)高效合成：將大腸桿菌裂解物與纖維素酶基因模板泵入螺旋管，在 30℃ 恒溫條件下持續(xù)產(chǎn)出酶蛋白，每小時(shí)產(chǎn)量達(dá) 120 mg/L，較批次反應(yīng)提高 8 倍。德國(guó) BRAIN AG 公司利用此技術(shù)生產(chǎn) 耐熱木聚糖酶，直接添加至造紙漿料中降解半纖維素，使漂白劑用量減少 30%。該系統(tǒng)還支持 實(shí)時(shí)補(bǔ)料——補(bǔ)充消耗的氨基酸和能量物質(zhì)可維持 48 小時(shí)穩(wěn)定表達(dá)，單位酶成本降至 $2.5/g，逼近發(fā)酵法經(jīng)濟(jì)閾值。體外蛋白表達(dá)作為??現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要工具之一??。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如，在COVID-19期間，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)被用于數(shù)小時(shí)內(nèi)合成病毒抗原，加速疫苗候選物篩選。美國(guó)DARPA支持的“生物制造”項(xiàng)目利用凍干無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑，在戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體，實(shí)現(xiàn)便攜式、無(wú)需冷鏈的即時(shí)生物制造。這類場(chǎng)景凸顯了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在時(shí)效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可整合非天然氨基酸（通過(guò)修飾tRNA）、脂質(zhì)體（用于膜蛋白表達(dá)）或翻譯后修飾酶（如糖基化酶）。芯片級(jí)體外蛋白表達(dá)??體現(xiàn)較前沿的進(jìn)展。hek293蛋白表達(dá)的優(yōu)勢(shì)

體外蛋白表達(dá)需使用??不含質(zhì)粒骨架的模板??以避免副反應(yīng)。his蛋白表達(dá)上調(diào)

盡管前景廣闊，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)市場(chǎng)仍面臨成本控制和規(guī)?；a(chǎn)的挑戰(zhàn)。目前反應(yīng)體系依賴昂貴的裂解物和能量試劑，限制了大規(guī)模應(yīng)用，但新型工程化裂解物（如敲除核酸酶的E. coli提取物）和能量再生系統(tǒng)的開發(fā)有望降低成本。未來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)技術(shù)可能與AI驅(qū)動(dòng)的蛋白設(shè)計(jì)、連續(xù)生物制造工藝結(jié)合，進(jìn)一步拓展在細(xì)胞zhi liao、人造肉（如無(wú)細(xì)胞合成血紅蛋白）等新興領(lǐng)域的應(yīng)用。Goverment與資本對(duì)生物制造的投入（如美國(guó)《國(guó)家生物技術(shù)和生物制造計(jì)劃》）也將加速無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的商業(yè)化進(jìn)程，使其成為千億美元合成生物學(xué)市場(chǎng)的重要支柱技術(shù)。his蛋白表達(dá)上調(diào)