由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見(jiàn)光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率，這種技術(shù)需要通過(guò)在陣列前引入額外的微透鏡陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)。除此之外，由于可見(jiàn)光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會(huì)產(chǎn)生光漂白，因而為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間，系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，經(jīng)過(guò)短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域；因?yàn)樾盘?hào)背景比高，所以具有更高的對(duì)比度；由于激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn)；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全。國(guó)外雙光子顯微鏡ultima2PPLUS雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。

有了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，使電子躍遷到更高的能級(jí)。短時(shí)間后，電子跳回到較低的能級(jí)，發(fā)出波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子(P=h/λ)。利用這個(gè)原理，雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光通過(guò)物鏡會(huì)聚。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，物鏡焦點(diǎn)處的光子密度比較高，所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點(diǎn)處產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光穿過(guò)物鏡，被光學(xué)探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開(kāi)展對(duì)多種臟器的成像研究。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率。國(guó)外investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而能夠達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么