配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而能夠達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。布魯克雙光子顯微鏡授權(quán)公司

有了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，使電子躍遷到更高的能級。短時間后，電子跳回到較低的能級，發(fā)出波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理，雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光通過物鏡會聚。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，物鏡焦點處的光子密度比較高，所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點處產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光穿過物鏡，被光學(xué)探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。國外ultima雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢？它能做普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發(fā)效應(yīng)只能發(fā)生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發(fā)光效率，減少掃描點以外的熒光物質(zhì)的消耗。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡的原理是什么？

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。進口激光雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?布魯克雙光子顯微鏡授權(quán)公司

目前，腦科學(xué)的研究在全球范圍內(nèi)如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，全景式分析腦連接圖和功能動態(tài)圖的研究成為重點研究方向，如何打破尺度壁壘，將微觀神經(jīng)元和突觸的信息處理和個體行為信息與全腦融合，是該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，北京大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院電子系、工程學(xué)院和中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成的跨學(xué)科團隊在NatureMethods上在線發(fā)表了一篇題為《大視場、多平面、長程腦成像的微型雙光子拷貝》的文章。本文報道了第二代小型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0。其成像視場是團隊2017年發(fā)布的第1代小型化顯微鏡的7.8倍。同時具有三維成像能力，獲得了小鼠自由運動行為時大腦三維區(qū)域數(shù)千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，實現(xiàn)了對同一批次神經(jīng)元一個月的跟蹤記錄。布魯克雙光子顯微鏡授權(quán)公司